一、形态学鉴定流程

样本采集

采集地点选择：蚊类可以在多种环境中采集，如人居住所（室内、蚊帐内等）、动物栖息地（如牛棚、猪圈等）、野外水体周边（池塘、河流、稻田等）。因为不同种类的蚊类对孳生环境有不同的偏好，例如按蚊多孳生于水流缓慢、水质清澈的水体；库蚊常见于污水坑、下水道等富含有机质的水体。

采集工具和方法

可以使用捕蚊网在蚊虫活动高峰期（清晨和傍晚）在草丛、树林等地方挥动捕蚊。对于室内静止的蚊虫，可用吸蚊管进行采集。对于栖息在墙壁等表面的蚊虫，还可以使用电动吸蚊器收集。

若要采集幼虫，可用水勺从水体中捞取，尤其要注意采集水体边缘和底部的幼虫，因为不同蚊种幼虫在水体中的栖息位置也有差异。

样本固定和保存

固定剂选择：常用的固定剂是 70% - 80% 的乙醇。乙醇可以使蚊虫的组织迅速脱水，防止腐败，同时还能保持蚊虫的形态结构基本不变。对于一些需要进行更精细形态观察的样本，也可以使用福尔马林（4% 甲醛溶液）固定，但福尔马林固定后的样本在后续处理过程中可能需要更复杂的清洗步骤。

保存方式：将固定好的蚊虫样本放入带有密封盖的小玻璃瓶或离心管中，在瓶身或管壁上标明采集地点、日期等信息。样本应保存在阴凉、干燥的环境中，避免阳光直射和温度剧烈变化。

形态观察前处理

清洗：如果样本是用福尔马林固定的，需要用缓冲液（如磷酸盐缓冲液）多次清洗，以去除残留的甲醛，防止甲醛对后续染色和观察产生干扰。如果是乙醇固定的样本，一般可直接用于观察，但如果样本表面有杂质，也可以用蒸馏水简单冲洗后再观察。

染色（可选）：为了更清晰地观察蚊虫的某些结构，如口器、内部器官等，可以对样本进行染色。常用的染色剂有品红、苏木精等。染色方法根据不同的染色剂有所不同，以品红染色为例，一般是将蚊虫样本放入稀释的品红溶液中浸泡数小时，然后用蒸馏水冲洗，直到冲洗液基本无色，这样可以使蚊虫的细胞和部分结构染上颜色，便于观察。

形态学观察

整体形态观察：使用体视显微镜，首先观察蚊虫的大小、颜色、形状等整体特征。例如，伊蚊一般体型较小，颜色多为黑色或黑褐色，有白色斑纹；按蚊体型相对较大，颜色多为灰色。

头部观察：重点观察蚊虫的触角、复眼和口器。触角的节数、形状在不同蚊种之间存在差异。口器是蚊虫的重要特征结构，雌蚊的口器为刺吸式，用于吸食血液，雄蚊口器相对退化。例如，按蚊的口器与库蚊的口器在细微结构上有所不同，按蚊口器的触须与喙等长，而库蚊的触须较短。

胸部观察：主要观察翅、足和胸节。翅脉的分布是蚊类鉴定的重要依据之一，不同蚊种的翅脉数量、形状和分支情况不同。例如，库蚊的翅脉上通常有鳞片形成的斑点，而伊蚊的翅脉相对比较清晰。足的形态包括跗节的数量、长度等也有差异，胸节的形状和颜色等也可以作为鉴定参考。

腹部观察：观察腹部的节数、形状、颜色和斑纹等。有些蚊种腹部有明显的银色或白色斑纹，如白纹伊蚊腹部有典型的白色纵纹，这些特征对于鉴定蚊种非常有帮助。

二、分子生物学鉴定流程

样本采集与处理（同形态学部分的样本采集，但要求更高的质量）

采集时要尽量避免样本的污染，因为分子生物学鉴定对样本的纯度要求较高。例如，在采集蚊虫样本用于DNA提取时，要确保采集工具的清洁，最好使用一次性的采集工具或者经过严格消毒的工具。

样本采集后，如果不能立即进行 DNA 提取，应尽快将样本保存在 - 20℃或 - 80℃的低温环境中，以防止 DNA 降解。

DNA 提取

提取方法选择：常用的方法有酚 - 氯仿提取法和商业 DNA 提取试剂盒法。酚 - 氯仿提取法是一种经典的方法，它利用酚和氯仿使蛋白质变性，离心后将 DNA 分离出来。但是这种方法操作比较复杂，且使用的试剂有毒。商业 DNA 提取试剂盒则相对简单方便，按照试剂盒的说明书操作，一般可以获得较高质量的 DNA。

质量检测：提取后的 DNA 可以通过琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。在电泳过程中，完整的 DNA 会呈现出清晰的条带，通过与标准分子量的 DNA marker 对比，可以判断提取的 DNA 是否完整以及大致的浓度。同时，也可以使用分光光度计测量 DNA 在 260nm 和 280nm 波长处的吸光度比值（A260/A280），来评估 DNA 的纯度，比值在 1.8 - 2.0 之间表示 DNA 纯度较好。

基因选择与扩增

基因选择：对于蚊类鉴定，常用的基因有细胞色素 C 氧化酶亚基 I（COI）基因、核糖体RNA基因（如 18S rRNA、28S rRNA）等。COI 基因具有较高的种间差异和较低的种内差异，是进行物种鉴定的理想基因。

PCR扩增：根据所选基因设计特异性引物，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。PCR 反应体系包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq 酶和缓冲液等。反应条件一般包括变性（94 - 95℃）、退火（根据引物的 Tm 值确定温度，一般在 45 - 60℃）和延伸（72℃）三个步骤，经过多个循环（通常 25 - 35 个循环），使目的基因片段得到大量扩增。

扩增产物检测与分析

琼脂糖凝胶电泳检测：将 PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察是否有预期大小的条带出现。如果有条带出现，且大小与预期相符，说明扩增成功。

测序分析：将扩增成功的产物送去专业的测序公司进行测序，或者使用实验室自己的测序设备测序。得到序列后，将其与已知蚊类物种的基因序列数据库（如 GenBank）进行比对，通过序列相似性分析来确定蚊种。可以使用 BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）等软件进行比对，一般序列相似度在 97% 以上可以初步判定为同一物种。